Original article

Factors affecting the successful cryopreservation of honey bee (Apis mellifera) spermatozoa^*

Facteurs jouant un rôle dans le succès de la cryopréservation de spermatozoïdes de l’abeille Apis mellifera

Faktoren, die die erfolgreiche Kältekonservierung von Spermatozoen der Honigbiene (Apis mellifera) beeinflussen

Center for Animals Near Biological Extinction, WA 99111, USA

Corresponding author: B.K. Hopkins, kingsley27@msn.com

Received: 14 April 2009
Revised: 19 November 2009
Accepted: 24 November 2009

Abstract

This report is about cryopreservation of honey bee semen. There has been little advancement of this technology over the past 20 years. Cytotoxicity of the cryoprotectants, temperature sensitivity, freezing rate, and cold shock were investigated. The least toxic cryoprotectant was DMSO. Spermatozoa were tolerant to temperatures up to 40 °C. A programmable freezing rate of 3 °C/min proved superior in most treatments when compared to a freezing rate of approximately 28000 °C/min. Highest viability of spermatozoa (93%) post cryopreservation resulted from the treatment containing a 10% DMSO diluent, slow cooled to just above freezing, and frozen at a rate of 3 °C/min. Spermatozoa frozen in such a manner yielded viability and motility indistinguishable from that of unfrozen semen. Promising results warrant a field study.

Zusammenfassung

Honigbienen können instrumentell besamt werden (I.B.). Das Potential der I.B. wird jedoch dadurch begrenzt, dass es unmöglich ist, den Samen über längere Zeiträume hinweg aufzubewahren. Da Einfrieren nicht möglich ist, muss aufgenommener Samen innerhalb von kurzer Zeit verbraucht werden. Geeignete Verfahren der Kältekonservierung würden jedoch die wiederholte Nutzung einer umfassenden Sammlung von Sperma während einer Saison, oder ihre Aufbewahrung zur Konservierung wertvoller genetischer Ressourcen erlauben.

Einflüsse, die möglicherweise die Lebensfähigkeit der Spermien nach dem Auftauen beeinflussen könnten, wurden untersucht. Ein Review ergab vier allgemeine Faktoren, auf die wir unsere Arbeit konzentrierten: (1) Zelltoxizität von Kälteschutzmitteln, (2) Temperaturempfindlichkeit von Spermien, (3) die Gefrierrate, und (4) Kälteschock. Samen wurde aufgenommen und vor dem Gebrauch für 7 Tage in einer Glaskapillare aufbewahrt. Der Samen wurde im Verhältnis von drei zu zwei mit verschiedenen Verdünnern gemischt. Die Zellgiftigkeit von Kälteschutzmitteln wurde getestet, indem der Samen mit Verdünner gemischt wurde, der Kälteschutzmittel enthielt, und dann für eine Stunde in Glaskapillaren aufbewahrt wurde. Das Überleben der Zellen wurde in der gesamten Studie durch eine Lebend-Tot-Fluoreszenzfärbung gemessen. Mit Lösungsmitteln, die 10 % DMSO enthielten, blieb die Beweglichkeit erhalten und 95 % der Spermatozoen überlebten. Wenn das Lösungsmittel jedoch 15 % DMSO enthielt, blieben nur 65 % der Spermazellen am Leben. Die Beweglichkeit der Spermatozoen ging deutlich zurück, wenn die Lösungsmittel Glyzerin oder EG enthielten; die Färbung ergab, dass in diesen Fällen 35 % bzw. 90 % der Zellen überlebten.

Die Temperaturempfindlichkeit wurde gemessen, indem Glaskapillaren mit der Samen/Lösungsmittelmischung für eine Stunde in verschieden temperierte Wassserbäder getaucht wurden. Proben, die Temperaturen von 30 °C, 35 °C, und 40 °C ausgesetzt wurden, zeigten keine signifikante Reduktion der Lebensfähigkeit. Die Probe, die einer Temperatur von 45 °C ausgesetzt wurde, zeigte dagegen einen deutlichen Rückgang der Lebensfähigkeit (Abb. 1).

Die Experimente zur Kryokonservierung wurden so angelegt, dass sechs verschiedene Kälteschutzmittel, zwei Gefrierraten und der Effekt von Kälteschock in einem kombinierten Ansatz untersucht werden konnten. Die Kombination von Faktoren, die zur größten Überlebensfähigkeit (93 %) beitrugen, war: Harbo’s Verdünnung mit 10 % DMSO, bei langsamer Abkühlung und Einfrieren in einem programmierbaren Gefriergerät bei 3 °C/min (Tab. I).

Die mit der Methode des langsamen Abkühlens von Samen in Harbo’s Verdünnung und Einfrieren in einem programmierbaren Gefriergerät erzielten Ergebnisse sind vielversprechend genug für Feldstudien. Offensichtlich liegt der Nutzen der Technologie in der Anwendbarkeit in der Praxis.