Original article

Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment^*

Localisation in situ des protéines du choc thermique et de la mort cellulaire dans les glandes hypopharyngiennes des ouvrières de l’abeille (Apis mellifera carnica) après traitement à l’immidaclopride et au coumaphos

In situ Lokalisierung von Hitzeschockproteinen und Zelltod in Hypopharynxdrüsen von Arbeiterinnen der Honigbiene (Apis mellifera carnica) nach Imidacloprid oder Coumaphos Behandlung

Agricultural Institute of Slovenia, Hacquetova 17, 1000 Ljubljana, Slovenia

Corresponding author: A. Gregorc, Ales.Gregorc@kis.si

Received: 18 September 2008
Revised: 20 February 2009
Accepted: 10 June 2009

Abstract

Worker honeybees (Apis mellifera carnica Polm.) were treated with imidacloprid or coumaphos. Significant effects of treatment and treatment duration were found on hypopharyngeal glands (HPG) acinus diameter (P < 0.05). Differences in the size of acini were evident in all long term (48 h and 72 h) treatments. Short term (24 h) imidacloprid treatment induced heat shock protein 70 (Hsp 70) localisation in nuclei and cytoplasm and Hsp 90 activity was found in most cell cytoplasm. Coumaphos triggered an increased level of programmed cell death, and imidacloprid induced extended necrosis in comparison to coumaphos. In 7–12 day old workers, the level of cell death after 48 hours of imidacloprid treatment was approximately 50% and increased to all cells after 72 hours. Programmed cell death remained at the normal level of approximately 10%. Our results suggest that both pesticide treatments have an influence on the reduced size of HPG and also on the extended expression of cell death.

Zusammenfassung

Arbeiterinnen der Honigbiene (Apis mellifera carnica Polm.), die in einem Brutschrank geschlüpft waren, wurden auf dem Thorax markiert und in weiselrichtige Völker gegeben. Danach wurden altersspezifische Gruppen aus jeweils acht markierten Arbeiterinnen gebildet und in Holzkäfigen gehalten. Die erste Gruppe bestand aus 1 bis 6 Tage alten Arbeiterinnen, die zweite aus 7 bis 12 Tage alten, die dritte Gruppe aus 13 bis 18 Tage alten und die vierte Gruppe aus 19 bis 32 Tage alten. Diese erhielten als Behandlung entweder: (1) eine Imidacloprid-Lösung (500 ng/kg in 35 % Zuckerwasser), (2) eine Coumaphos-Lösung oder (3) als Kontrolle 35 % (w/v) Zuckerwasser. Die Arbeiterinnen konnten diese Lösungen über 24, 48 oder 72 Stunden ad libitum aufnehmen. Am Ende der jeweiligen Behandlungsperioden wurden die Hypopharynxdrüsen dieser Bienen entnommen, fixiert und in Wachs eingebettet. Für alle Alters- und Behandlungsgruppen wurden immunhistologische Präparate angefertigt und ‘morphometrische Messungen durchgeführt, die statistisch ausgewertet wurden. Entwachste Schnitte wurden mit Primärantikörpern gegen die Hitzeschockproteine 70 und 90 (Hsp 70 und Hsp 90) inkubiert. Zelltodereignisse wurden mittels TUNEL Reagenz des ‘In situ cell death detection kit, AP’ (Roche) erfasst. Als zweites Detektionsverfahren für Zelltod verwendeten wir das Apop Tag in situ Apoptosis detection kit (Chemiocon). Damit erfassten wir die Prozentsätze an Zellen, die behandlungsbedingten Zelltod oder Hitzeschockproteine aufwiesen. Wir konnten signifikante Unterschiede im Acinus-Durchmesser der Drüsen in Abhängigkeit von der Behandlung und der Behandlungsdauer erkennen, wobei die Unterschiede in der Acinus-Größe vor allem bei den Langzeitbehandlungen (48 und 72 Std.) deutlich waren. Bei der Kurzzeitbehandlung (24 Std.) mit Imidacloprid wurde Hsp 70 induziert und war sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern zu finden, während Hsp 90 im Zytoplasma der meisten Zellen nachweisbar war. Die Hsp-Aktivität war bei Coumaphos behandelten Gruppen deutlicher als bei den Imidacloprid behandelten. Coumaphos führte außerdem zu höheren Zelltodraten als Imidacloprid, während nach Imidaclopridbehandlung mehr Nekroseschäden zu sehen waren. Bei den 7–12 Tage alten Arbeiterinnen lag die Zelltodrate nach 48 stündiger Imidacloprid-Behandlung bei 50 % und erfasste bei längerer Behandlung (72 Std.) nahezu alle Zellen. Die normalen Zelltodraten bei Kontrollen lagen bei 10 %. Wir schliessen daraus, dass beide Pestizide die Größe der Hypopharynxdrüsen negativ beeinflussen können und dass eine längere Exposition zum Zelltod führt. Unser Versuchsansatz erlaubt es auch, subletale Effekte auf bestimmte Organe erkennen zu können. Diese Nachweisverfahren können damit Hilfsmittel darstellen, um die zelluläre Antwort in Hypopharynxdrüsen nach Feldeinsätzen von Imidacloprid, bzw. von Coumaphos in Bienenvölkern zu erfassen.